Le tre fasi della PCR

Finalmente si cuoce la torta, prendiamo la provetta e la inseriamo nel termociclatore, che cosa succede adesso? La cottura consiste nel sottoporre la provetta ad un certo numero di cicli di variazioni termiche. Ogni ciclo termico è composto di tre fasi. Si alternano momenti di riscaldamento delle provette a fasi di raffreddamento.
1°fase: denaturazione
In questo primo passaggio della reazione PCR, avviene la totale separazione dei due filamenti della catena di DNA target da replicare. Solitamente la temperatura applicata alla provetta deve raggiungere i 94°C per 30-60 secondi. Scaldando il DNA avviene lo srotolamento della doppia elica e l’allontanamento dei due filamenti, si dice che il DNA si denatura.
2°fase: ibridazione dei primers 
Si tratta del momento più delicato in cui i primers devono “ibridare stabilmente” al DNA stampo. Che cosa significa? Vuol dire che i filamenti primers che abbiamo aggiunto nella miscela devono accoppiarsi con i filamenti singoli e divisi dell’originario DNA target. Solitamente si procede per tentativi sperimentali con lo scopo di trovare la temperatura ideale per favorire l’accoppiamento “catenelle – primers con catenelle – target” a seconda del tipo di campione di DNA che si vuole replicare. Di solito la temperatura viene abbassata fino a circa 30 – 55 °C.
3°fase: estensione delle nuove catene di DNA
La temperatura ottimale per la polimerizzazione cioè la costruzione di filamenti di DNA identici a quelli del DNA target dipende dall’enzima DNA polimerasi utilizzato. Attualmente si usa un enzima che si chiama Taq polimerasi e si applicano generalmente 65 – 72°C per 5 minuti. In questa fase l’enzima polimerasi attacca, appiccica fisicamente i mattoncini base della catena (i nucleotidi) ai filamenti primers che sono appaiati e complementari ai filamenti target. In pratica avviene la copiatura d’ogni singolo filamento target. La DNA polimerasi attua la correzione d’errori nel caso si verifichi l’incorporamento di un nucleotide “sbagliato”, eventualità che può accadere dato che il meccanismo non è mai perfetto. Quindi la DNA polimerasi è in grado di eliminare l’errore e di creare un corretto appaiamento con il corrispondente nucleotide presente sul filamento che viene copiato e replicato.
Durante il primo ciclo della reazione PCR vengono sintetizzati nuovi filamenti, che dopo denaturazione cioè divisione della doppia elica e allontanamento delle catenelle parallele, possono accoppiarsi con i primers. Questi prodotti si accumulano aritmeticamente, ma è solo dal secondo ciclo di reazione che si formano due prodotti a singola elica, che costituiranno un tratto identico al DNA a doppia elica target.
Quindi attraverso ripetuti cicli di denaturazione, ibridazione dei primers ed estensione degli stessi si ottiene un accumulo esponenziale del segmento bersaglio di DNA target.
Durante ogni ciclo di “cottura” il numero dei frammenti di DNA che si vogliono copiare (cioè quelli posti fra i due primers) raddoppia. Dopo solo 32 cicli ripetuti si sono già formati milioni di copie di frammenti di DNA a doppia elica uguali al DNA target .
A questo punto la torta è pronta e la possiamo togliere dal forno, il dolce sarà lievitato e cotto, pronto per essere assaggiato. Allo stesso modo la provetta tolta dal termociclatore, al termine di tutti i cicli termici di “cottura” e raffreddamento a cui è stata sottoposta, è pronta, la metodica PCR è terminata. Le numerosissime copie di DNA, uguali a quelle della sequenza originaria che abbiamo voluto replicare, sono disponibili per essere in seguito analizzate e utilizzate in vari modi secondo lo scopo dell’esperimento.

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