Dentro la provetta

Come funziona una PCR?
Il Dr. Mullis, avvalendosi delle sue vaste conoscenze sul DNA e di tutte le attrezzature di laboratorio disponibili negli anni ’80, inizia a svolgere gli esperimenti per realizzare l’idea geniale che ha avuto sul vialetto quella sera. Il suo scopo è definire un metodo che partendo da un tratto di DNA, gli permetta di copiarlo tante volte “in vitro” cioè in una provetta. Il principio teorico del funzionamento del metodo PCR si può raccontare come ora vedremo.
Con un po’ di fantasia paragoniamo l’esecuzione d’esperimento di PCR in laboratorio alla preparazione di una torta in cucina. Per iniziare a preparare la torta disponiamo gli ingredienti necessari sul tavolo (uova, latte, burro, lievito, farina, etc.) e poi li misceliamo in una terrina. Nel caso dell’allestimento di una reazione di PCR disponiamo sul bancone da laboratorio vari componenti biologici e chimici (gli ingredienti della torta) contenuti in appositi contenitori come provette, pipette e vasetti. Bisogna eseguire dei passaggi preliminari alla preparazione della torta come dividere il tuorlo dall’albume dell’uovo, o lavorare il burro troppo freddo. Nel caso della PCR vanno eseguiti alcuni passaggi prima di mischiare tutto in un’unica provetta finale (la terrina per fare l’impasto).
Estrazione del DNA
Prima di tutto dobbiamo estrarre il DNA dal nucleo della cellula in cui è contenuto. Per esempio bisogna far uscire il DNA da cellule batteriche o ematiche oppure da dei resti di una mummia umana o animale. Si procede quindi eseguendo vari passaggi con alcuni composti chimici e sottoponendo il campione cellulare a trattamenti adatti al tipo di campione stesso. In sostanza dobbiamo demolire la struttura cellulare, vale a dire rompere tutte le cellule del campione in modo da favorire la fuoriuscita del DNA. Poi è necessario digerire le proteine che sono associate alle molecole di DNA, questo vuol dire che alla fine del procedimento si ottiene una soluzione che contiene solo il DNA che è stato separato dalle proteine digerite, le quali si sono trasformate in aminoacidi (i mattoncini che costituiscono le proteine). Alla fine di questo passaggio iniziale avremo una provetta in cui è disciolto il DNA in un liquido per esempio l’etanolo, in questo ambiente il DNA non è solubile quindi i suoi filamenti sono visibili in sospensione nella provetta.
I componenti della reazione PCR
Essi sono gli ingredienti della torta ancora non mischiati. Sul tavolo da laboratorio abbiamo il DNA estratto contenente la sequenza precisa che si vuole copiare tante volte viene chiamato target e l’obbiettivo dell’esperimento è moltiplicare questo specifico pezzetto. Quindi d’ora in poi usiamo la “convenzione” di chiamare la sequenza di DNA che si vuole copiare “target”, in modo da non confonderla con altri tratti di DNA che partecipano alla PCR.
Inoltre servono due ulteriori tratti di DNA che si chiamano primers, il loro scopo è di funzionare da iniziatori della copiatura e replicazione del DNA target, cioè aiutano e innescano l’inizio della replicazione. Durante la reazione di pcr, il filamento target viene sottoposto a calore quindi la sua doppia elica si apre: si ottengono così due catenelle divise che prima formavano il DNA target. Qui intervengono i primers che si accoppiano, in pratica si dispongono vicino ad ogni catenella singola di DNA target. Ora inizia la copiatura del DNA.
Perché avvenga la replicazione del target abbiamo bisogno anche di un altro ingrediente, la DNA polimerasi, come abbiamo già visto è un enzima cellulare. La DNA polimerasi ha anche la funzione di replicare e riparare il DNA. La polimerasi è in grado di allungare un filamento iniziatore (primer) aggiungendo uno per volta dei nucleotidi che sono i mattoncini che compongono le catene di DNA.
Nella ricetta bisogna ancora aggiungere una miscela di piccoli mattoncini liberi, unità base delle catene di DNA, i nucleotidi che servono per costituire i nuovi filamenti di DNA. Abbiamo già descritto cosa sono i nucleotidi al punto 1.
Manca solo un miscuglio di altri elementi di supporto (come potrebbero essere il sale o la scorza di limone grattugiata nella torta) come per esempio magnesio che serve a creare l’ambiente chimico giusto perché avvenga la reazione.
Il termociclatore
Si tratta del forno per cuocere la torta. Abbiamo tutto quello che serve e quindi mischiamo tutti gli ingredienti in un’unica provetta che corrisponde al versare la miscela per la torta in una teglia. Per cucinare una torta mettiamo la teglia nel forno e facciamo cuocere per un determinato tempo ad una certa temperatura, in questo caso mettiamo la provetta che contiene tutti i composti in un termociclatore. Si tratta di uno strumento da laboratorio che ha un termostato: possiamo quindi regolare e programmare le variazioni di temperatura e i tempi applicati a ciascuna delle tre fasi dell’amplificazione cioè i tre passaggi che ora vedremo necessari per copiare tante volte il DNA target (la cottura del dolce). Il funzionamento del termociclatore si basa su differenti sistemi di riscaldamento e raffreddamento attraverso aria, liquidi, resistenze elettriche etc. Il termociclatore ha un cassettino in cui vengono inserite le provette in cui avviene la reazione PCR, ne esistono in commercio di diversi tipi di varie grandezze per tutte le esigenze di laboratorio.

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